FFPE樣本,即福爾馬林固定石蠟包埋組織樣本。在臨床研究中組織離體后,其原有的形態(tài)功能很難完整地保存,因此通過(guò)甲醛固定以及石蠟包埋的方式可以最大限度地保存樣本的完整性以及生物大分子的完整性,因此FFPE樣本也成為了臨床蛋白質(zhì)組學(xué)研究的寶貴資源。但是目前FFPE樣本蛋白組學(xué)樣本制備仍存在著標(biāo)準(zhǔn)化程度低、效率低、重復(fù)性低和擴(kuò)展性差等問(wèn)題,靶點(diǎn)科技給您介紹一種FFPE樣本蛋白組學(xué)樣本制備新方法 ---Covaris 自動(dòng)聲波聚焦技術(shù)。
Covaris AFA聚焦超聲+S-Trap 方法-FFPE樣本蛋白提取新方法
圖1. 多種處理組合實(shí)驗(yàn)表。FFPE處理,傳統(tǒng):二甲苯-乙醇,探頭,甲醇-氯仿;HYPERsol:SDS溶解,AFA超聲,S-Trap。新鮮冰凍處理,F(xiàn)PS:冰凍,探頭,S-Trap;FUS:冰凍,超聲,S-Trap。
Covaris AFA聚焦超聲+S-Trap 方法提高了FFPE樣品的覆蓋深度
首先,作者用質(zhì)譜檢測(cè)了多種處理組合的人類肝臟樣品,發(fā)現(xiàn)相較于傳統(tǒng)(“XPM")的FFPE樣品處理,HYPERsol (“DUS")的結(jié)果是多識(shí)別11211種(37%)肽類和644種(24%)蛋白質(zhì)組,接近于新鮮冰凍樣品檢測(cè)深度(“FPS")。相較于傳統(tǒng)工作流程,DPS和HYPERsol的平均蛋白質(zhì)序列覆蓋率均有顯著提高,從20.0%到23.9%(圖2)。
圖2. 相較于傳統(tǒng)的工作流程,HYPERsol提高了FFPE樣本的蛋白覆蓋深度。a 新鮮肝臟樣品被制作成新鮮冰凍樣品或FFPE樣品。b 實(shí)驗(yàn)條件表。c、d 不同條件下的肽類和蛋白質(zhì)組數(shù)量鑒定。e 不同條件下蛋白質(zhì)序列覆蓋率的密度圖。星號(hào):與FPS相比;n = 3;* :p < 0.05,** :p < 0.01,*** :p < 0.001。
Covaris AFA聚焦超聲+S-Trap 方法提取FFPE蛋白質(zhì)與新鮮冰凍組織相媲美
接下來(lái),作者評(píng)估了FFPE樣本中提取的蛋白質(zhì)與冰凍組織中提取的蛋白質(zhì)的差異程度。蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集的皮爾遜相關(guān)系數(shù)顯示,HYPERsol(FFPE)數(shù)據(jù)集與FUS(冰凍)數(shù)據(jù)集非常相似,平均相關(guān)系數(shù)達(dá)0.936,顯著高于傳統(tǒng)方法與FUS相似性(0.852)。火山圖表明,“HYPERsol與FUS處理"的蛋白質(zhì)組的相對(duì)豐度差異顯著小于“傳統(tǒng)和FUS處理"蛋白質(zhì)組的相對(duì)豐度差異,HYPERsol法處理FFPE樣本更能真實(shí)還原原始組織的組成(圖3)??傮w而言,利用HYPERsol法從FFPE樣本中提取蛋白質(zhì)與從冰凍組織中提取蛋白質(zhì)的水平相媲美!
圖3. HYPERsol產(chǎn)生的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)與新鮮冰凍組織相似。b、c不同條件下肽類和蛋白質(zhì)組的數(shù)量鑒定。n = 3;星號(hào):與HYPERsol相比;* :p < 0.05,** :p < 0.01,*** :p < 0.001。d 散點(diǎn)圖描述了每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)與FUS數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性,R值:皮爾遜相關(guān)系數(shù)。e 相關(guān)矩陣描述了所有成對(duì)運(yùn)行比較中的皮爾遜相關(guān)系數(shù)。f、g 火山圖比較了傳統(tǒng)和FUS條件下、HYPERsol和FUS條件下檢測(cè)到的蛋白質(zhì)的相對(duì)豐度差異。
FFPE存檔樣本蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定成為可能
以上,作者證實(shí)了HYPERsol法在FFPE樣本的蛋白質(zhì)提取中占據(jù)重要優(yōu)勢(shì)。此外,作者對(duì)以往難以診斷的惡性外周神經(jīng)鞘膜瘤(MPNST),以及與其難以區(qū)分的黑色素瘤和滑膜肉瘤進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)HYPERsol法特別適合于鑒定新的免疫組織化學(xué)(IHC)標(biāo)記,以促進(jìn)組織形態(tài)學(xué)非特異的腫瘤診斷。
圖4. HYPERsol使FFPE存檔組織樣本的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定成為可能。a?c 惡性外周神經(jīng)鞘膜瘤、黑色素瘤和滑膜肉瘤的H&E染色。d 3種腫瘤類型中識(shí)別的蛋白質(zhì)組數(shù)箱圖。e 3種腫瘤類型之間檢測(cè)到的蛋白質(zhì)重疊維恩圖。f 散點(diǎn)圖,描繪標(biāo)本的儲(chǔ)存期與已確定的蛋白質(zhì)組數(shù)之間的關(guān)系。虛線表示具有95%可信區(qū)間的最佳擬合線;R值和P值基于皮爾遜與乘積矩相關(guān)性。g、h MPNST和黑色素瘤、黑色素瘤和滑膜肉瘤中差異蛋白表達(dá)的火山圖。I-k TYR、TLE1和ICAM5在3種腫瘤中的豐度表達(dá)。* : p<0.001,** : p<0.0001。
總結(jié)
參考文獻(xiàn):Dylan M. Marchione, et al. HYPERsol: High-Quality Data from Archival FFPE Tissue for Clinical Proteomics. J. Proteome Res. 2020, 19(2): 973-983.
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