巨噬細(xì)胞是造血系統(tǒng)中*可塑性的細(xì)胞，存在于所有組織中，具有豐富的功能多樣性。巨噬細(xì)胞參與細(xì)胞碎片和病原體的識(shí)別、吞噬和降解，并且在向T細(xì)胞提呈抗原以及誘導(dǎo)其他抗原呈遞細(xì)胞表達(dá)共刺激分子等方面發(fā)揮作用，從而啟動(dòng)適應(yīng)性免疫反應(yīng)。

除此之外，巨噬細(xì)胞還在維持組織穩(wěn)態(tài)以及組織的修復(fù)和重塑方面發(fā)揮作用。當(dāng)遇到不同的抗原刺激時(shí)，單核細(xì)胞會(huì)變成高度殺傷性的巨噬細(xì)胞（M1），或變成免疫抑制性的巨噬細(xì)胞（M2）。

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

一、THP-1細(xì)胞的極化

1) THP-1細(xì)胞鋪板，將佛波酯PMA（100 ng/ml）加入*培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)其向巨噬細(xì)胞的成熟；

2) 48小時(shí)后THP-1細(xì)胞成熟為巨噬細(xì)胞，外觀圓形高折光，從懸浮狀態(tài)快速變成貼壁狀態(tài)；

3) 將成熟的巨噬細(xì)胞消化下來(lái)（Accutase酶消化：專門(mén)用于消化貼壁細(xì)胞），重新鋪板，誘導(dǎo)向M1-like、M2-like的極化。

4) 與IFN-γ(20 ng/ml)和LPS(100 ng/ml)孵育48小時(shí)以上，使其向M1極化。

與IL-4(20 ng/ml)和IL-13(20 ng/ml)孵育48小時(shí)以上，使其向M2極化。

5) 極化完成后，細(xì)胞用不含刺激物的無(wú)血清RPMI重懸，可保持72小時(shí)。

二、單核細(xì)胞來(lái)源巨噬MDM

1) 將單核細(xì)胞以5×105/ml的濃度接種在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，同時(shí)加入20 nM的CSF-1。

2) 單個(gè)核細(xì)胞在37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)7天，每3天更換一次培養(yǎng)液，獲得MDM。

3) MDM得到之后，去除原培養(yǎng)基，更換新的培養(yǎng)基。

4) 若與新鮮的、無(wú)血清的RPMI繼續(xù)培養(yǎng)，則維持M0狀態(tài)。

5) 與LPS(1 μg/ml)和IFN-γ(10 ng/ml)孵育48小時(shí)，則向M1極化。

與IL-4(20 ng/ml)和IL-13(5 ng/ml)孵育48小時(shí)，則向M2表型極化。

6) 極化完成后，細(xì)胞用不含刺激物的無(wú)血清RPMI重懸，可保持72小時(shí)。

三、骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞BMDM

1) 將分離的骨髓細(xì)胞以2×106/ml的濃度接種在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的IMDM培養(yǎng)基中，同時(shí)加入10 ng/ml M-CSF。

2) 在第3天更換新鮮的BMDM生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

3) 第7天，熒光團(tuán)偶聯(lián)抗體染色，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表達(dá)CD11b和F4/80的細(xì)胞來(lái)評(píng)估成熟BMDM的形成。

4) 第7天，成熟BMDM的形成后改為新鮮刺激培養(yǎng)基。

5) 與100 ng/ml LPS或含有50 ng/ml IFNγ的100 ng/ml LPS共孵育，則向M1極化。

與10 ng/ml IL-4和/或10 ng/ml IL-13共孵育，則向M2極化。

6) 用0.05%的胰蛋白酶將受刺激的細(xì)胞從培養(yǎng)皿中分離出來(lái)，然后用含有10%胎牛血清的PBS洗滌細(xì)胞兩次。

四、RAW264.7細(xì)胞極化

1) 將RAW264.7細(xì)胞重懸在含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。

2) 將傳至2-5代的細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

3) 并將培養(yǎng)基換成不含胎牛血清的*培養(yǎng)基。

4) 與100 ng/ml LPS共孵育，則向M1極化。

與20 ng/ml IL-4（可添加20 ng/ml IL-10）共孵育，則向M2極化。

下表為對(duì)以上4種細(xì)胞誘導(dǎo)試劑進(jìn)行的簡(jiǎn)要匯總

參考文獻(xiàn)：

[1] Saqib U, Sarkar S, Suk K, Mohammad O, Baig MS, Savai R. Phytochemicals as modulators of M1-M2 macrophages in inflammation. Oncotarget. 2018 Apr 3;9(25):17937-17950.

[2] Mohammad NS, Nazli R, Zafar H, Fatima S. Effects of lipid based Multiple Micronutrients Supplement on the birth outcome of underweight pre-eclamptic women: A randomized clinical trial. Pak J Med Sci. 2022 Jan-Feb;38(1):219-226.

[3] Tedesco S, De Majo F, Kim J, Trenti A, Trevisi L, Fadini GP, Bolego C, Zandstra PW, Cignarella A, Vitiello L. Convenience versus Biological Significance: Are PMA-Differentiated THP-1 Cells a Reliable Substitute for Blood-Derived Macrophages When Studying in Vitro Polarization? Front Pharmacol. 2018 Feb 22;9:71.

[4] Ying W, Cheruku PS, Bazer FW, Safe SH, Zhou B. Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages. J Vis Exp. 2013 Jun 23;(76):50323.

[5] Kimbrough D, Wang SH, Wright LH, Mani SK, Kasiganesan H, LaRue AC, Cheng Q, Nadig SN, Atkinson C, Menick DR. HDAC inhibition helps post-MI healing by modulating macrophage polarization. J Mol Cell Cardiol. 2018 Jun;119:51-63.